Возможность культивирования церебральных органоидов или «мини-мозговых мозгов» с использованием стволовых клеток, полученных от людей, дала ученым экспериментально поддающиеся манипуляции модели неврологического развития и болезней человека, но не без сложных проблем. Нет двух одинаковых органоидов и ни один из них не похож на настоящий мозг. Эта проблема «снежинки» сдерживает науку, затрудняя научно значимые количественные сравнения. Чтобы помочь исследователям преодолеть эти ограничения, нейробиологи и инженеры Массачусетского технологического института разработали новый конвейер для очистки, маркировки, трехмерной визуализации и тщательного анализа органоидов.
Названный «SCOUT» для «одноклеточного и цитоархитектурного анализа органоидов с использованием непредвзятых методов», процесс может извлекать сопоставимые характеристики среди целых органоидов, несмотря на их уникальность — способность, которую исследователи демонстрируют в трех тематических исследованиях в своей новой статье в Scientific Reports. Например, в одном из тематических исследований команда сообщает о новых моделях нарушения развития органоидов из-за вирусной инфекции Зика, что дает новое понимание того, почему дети, рожденные от инфицированных матерей, могут иметь серьезные неврологические нарушения.
«Когда вы имеете дело с натуральными тканями, вы всегда можете разделить их с помощью стандартного атласа тканей, поэтому яблоки легко сравнивать с яблоками», — сказал соавтор исследования Александр Альбанезе, научный сотрудник лаборатории старшего автора статьи. , Доцент Кванхун Чанг. «Но когда каждый органоид представляет собой снежинку и имеет свое собственное уникальное сочетание характеристик, как узнать, что наблюдаемая вами изменчивость обусловлена самой моделью, а не биологическим вопросом, на который вы пытаетесь ответить? Мы были заинтересованы в том, чтобы преодолеть шум системы для количественных сравнений «.
Альбанезе руководил исследованием вместе с бывшим аспирантом Массачусетского технологического института Джастином Свани. Команда предприняла дополнительный шаг, поделившись своим программным обеспечением и протоколами на GitHub, чтобы его можно было свободно использовать. Чанг сказал, что, поделившись многими инновациями в области обработки, маркировки и анализа тканей своей лаборатории, он надеется ускорить биомедицинский прогресс.
«Мы разрабатываем все эти технологии, чтобы обеспечить более целостное понимание сложных биологических систем, что необходимо для ускорения темпов открытий и разработки терапевтических стратегий», — сказал Чанг, исследователь из Института обучения и памяти Пикауэра и Института. для медицинской инженерии и естественных наук, а также преподаватель химического машиностроения, мозга и когнитивных наук. «Распространение этих технологий так же важно, как и их развитие, чтобы оказывать реальное влияние».
Абстрактная архитектура
Некоторые из технологий лаборатории Чанга являются составными частями конвейера SCOUT. Процесс начинается с создания оптически прозрачных органоидов, чтобы их можно было визуализировать с сохранением их трехмерной структуры — ключевой возможности, по словам Чанга, для изучения целых органоидов как развивающихся систем. Следующим шагом SCOUT является введение в очищенные органоиды меток антител, нацеленных на определенные белки, чтобы подчеркнуть идентичность и активность клеток. После очистки и маркировки органоидов команда Чанга изучает их с помощью светового микроскопа, чтобы получить полную картину всего органоида с разрешением одной клетки. В общей сложности каждый органоид производит около 150 ГБ данных для автоматического анализа с помощью программного обеспечения SCOUT, кодируемого главным образом Swaney.
Высокопроизводительный процесс позволяет обрабатывать множество органоидов, что гарантирует, что исследовательские группы могут включить множество образцов в свои эксперименты.
По словам Альбанезе, команда выбрала метки антител стратегически. С целью различения клеточных паттернов, возникающих во время развития органоидов, команда решила пометить белки, специфичные для ранних нейронов (TBR1) и радиальных глиальных клеток-предшественников (SOX2), поскольку их организация влияет на последующее развитие коры. Команда внедрила в SCOUT алгоритмы для точной идентификации каждой отдельной клетки в каждом органоиде.
Отсюда SCOUT может начать распознавать общие архитектурные паттерны, такие как определение мест скопления похожих клеток или областей большего разнообразия, а также того, насколько близко или далеко разные популяции клеток находятся от желудочков или полых пространств. При развитии мозга и органоидов клетки организуются вокруг желудочков, а затем мигрируют радиально. С помощью методов, основанных на искусственном интеллекте, SCOUT смог отследить паттерны различных популяций клеток от каждого желудочка. Таким образом, работая с системой, команда смогла выявить сходства и различия в конфигурациях клеток или цитоархитектурах каждого органоида.
В конечном итоге исследователи смогли создать набор из почти 300 функций, по которым можно было сравнивать органоиды, от уровня отдельных клеток до уровня целых тканей. Чанг сказал, что при дальнейшем анализе и выборе различных молекулярных меток можно разработать еще больше функций. Примечательно, что функции, извлеченные SCOUT, беспристрастны, потому что они являются продуктами анализа программного обеспечения, а не предопределенными гипотезами о том, что «предполагается» значимым.
Научные сравнения
С набором аналитического конвейера команда проверила его. В одном тематическом исследовании они использовали его, чтобы выявить тенденции развития органоидов путем сравнения особей разного возраста. СКАУТ выявил десятки значительных различий не только в общем росте, но и в изменениях пропорций типов клеток, различиях в слоистости и других изменениях в архитектуре тканей, соответствующих созреванию.
В другом тематическом исследовании они сравнили разные методы культивирования органоидов. Соавторы из Гарвардского университета Паола Арлотта и Сильвия Веласко разработали метод, который, согласно анализу секвенирования одноклеточной РНК, дает более стабильные органоиды, чем другие протоколы. Команда использовала SCOUT, чтобы сравнить их с органоидами, производимыми традиционным способом, чтобы оценить их стабильность в масштабе ткани. Они обнаружили, что органоиды «Веласко» демонстрируют улучшенную согласованность в своей архитектуре, но все же показывают некоторые различия.
Зика идеи
Третий случай, связанный с вирусом Зика, не только доказал полезность SCOUT для обнаружения серьезных изменений, но и привел к обнаружению редких событий. Группа Чанга сотрудничала с вирусным экспертом Ли Герке, профессором Германа Л.Ф. фон Гельмгольца в IMES, чтобы определить, как инфекция Зика повлияла на развитие органоидов. SCOUT обнаружил 22 основных различия между инфицированными и неинфицированными органоидами, включая некоторые, которые ранее не были задокументированы.
«В целом этот анализ обеспечил первую в своем роде всестороннюю количественную оценку патологии, опосредованной вирусом Зика, включая потерю клеток, сокращение желудочков и общую реорганизацию тканей», — пишут авторы. «Мы смогли охарактеризовать пространственный контекст редких клеток и выделить групповые различия в цитоархитектурах. Фенотип инфекции уменьшал размер органоидов, рост желудочков и рост клеток SOX2 и TBR1. Учитывая наши наблюдения, что количество клеток SOX2 коррелирует с многомасштабными характеристиками ткани ожидается, что потеря нейральных предшественников, связанная с вирусом Зика, снизилась в плане сложности топографии ткани и формирования клеточного паттерна ».
Чанг сказал, что его лаборатория также сотрудничает с коллегами, изучающими аутизмоподобные расстройства, чтобы узнать больше о различиях в развитии.
Исследование было поддержано источниками финансирования, включая Фонд JPB, Культурный фонд NCSOFT и Национальные институты здравоохранения.
Источник истории:
Материалы предоставлены Институтом Пикауэра при Массачусетском технологическом институте . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.
